實(shí)驗(yàn)?zāi)康?nbsp;

1、掌握聚酰胺薄膜層析技術(shù)的基本方法和應(yīng)用。 2、熟悉蛋白質(zhì)及肽的N末端氨基酸DNS分析法。  

實(shí)驗(yàn)原理 

熒光試劑二甲氨基萘磺酰氯(dansyl-Cl，簡稱DNS-C1)在堿性條件下與氨基酸(肽或蛋白質(zhì))的氨基結(jié)合成帶有熒光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白質(zhì))，DNS-蛋白質(zhì)再經(jīng)酸水解可釋放出DNS-氨基酸。 

DNS-C1能與所有的氨基酸生成具熒光的衍生物，其中賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成雙DNS-氨基酸衍生物。這些衍生物相當(dāng)穩(wěn)定，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸組成的微量分析，靈敏度可達(dá)10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比過去常用的FDNB法高100倍。將Edman法和DNS法結(jié)合起來(稱為Edman-DNS法)應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的序列分析上作，可以提高Edman法的靈敏度及其分析速度。DNS-氨基酸衍生物在6mol/L鹽酸中105℃水解22小時，除DNS-色氨酸全部被破壞，DNS-脯氨酸(77％)，絲氨酸(35％)，甘氨酸(18％)，丙氨酸(7％)部分被破壞外，其余DNS-氨基酸很少破壞。故DNS法可用于蛋白質(zhì)和肽的氨基酸組成N末端分析。 

DNS-C1與蛋白質(zhì)的側(cè)鏈基團(tuán)巰基、咪唑基、ε-氨基和酚羥基反應(yīng)，前兩者在酸堿條件下均不穩(wěn)定，酸水解時完全破壞；DNS-ε-賴氨酸和DNS-O-酪氨酸較穩(wěn)定，同時還有DNS-雙-賴氨酸和DNS-雙-酪氨酸生成，層層后在層析圖譜的位點(diǎn)上，都與DNS-α-氨基酸有區(qū)別。 

聚酰胺是—類化學(xué)纖維原料，即錦綸(又稱尼龍)。由己二酸與己二胺聚合而成的稱錦綸66 。因?yàn)樵谶@類物質(zhì)分子中都含有大量酰胺基團(tuán)，故統(tǒng)稱聚酰胺。它對很多極性物質(zhì)有吸附作用，這是由于聚酰胺的一C＝O及>NH基能與被分離物質(zhì)之間形成氫鍵。如酚類(包括黃酮類、鞣質(zhì)等)和酸類<如核苷酸、氨基酸等)是以其羥基與酰胺鍵的羰基形成氫鍵；硝基化合物和醌類等物質(zhì)與酰胺鍵的氨基形成氫鍵。被分離物質(zhì)形成氫鍵能力的強(qiáng)弱，確定吸附能力的差異。在層析過程中，層層溶劑與被分離物質(zhì)在聚酰胺表面競相形成氫鍵。因此選擇適當(dāng)?shù)恼箤尤軇贡环蛛x物質(zhì)在溶劑與聚酰胺表面之間的分配系數(shù)能有較大差異，經(jīng)過吸附與解吸的展層過程，可以一一分離。  

實(shí)驗(yàn)器材及試劑 

器材：聚酰胺薄膜（7cm×7cm）、小鐘罩、吹風(fēng)機(jī)、小離心管、毛細(xì)管、紫外分析儀、小培養(yǎng)皿、移液槍 

試劑：pH9.9 的標(biāo)準(zhǔn)賴氨酸、丙氨酸、苯丙氨基酸，混合氨基酸；展層液（以甲酸：水==1.5:100配制）

 

操作方法 

1、DNS-Cl標(biāo)記PH9.9的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸 

    取4個小離心管，分別加入三種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以及混合氨基酸各30微升，在各加入30微升DNS-Cl丙酮溶液，充分混合。然后將4個離心管在37度水浴中保溫1h。 2、點(diǎn)樣 

    在距邊0.5cm處畫一基線，在上面每隔1.5 cm畫—點(diǎn)作為點(diǎn)樣位置。用毛細(xì)管取樣，點(diǎn)在聚酰胺薄膜點(diǎn)樣位置上，點(diǎn)樣直徑不得超過2mm，若需要多次點(diǎn)樣時，應(yīng)當(dāng)將**次樣品點(diǎn)吹干后，再點(diǎn)第二次。 3、展層 

將點(diǎn)完樣的聚酰胺薄片光滑面向外，聚酰胺面向內(nèi)，箍以線圈或膠片圈(將舊的35 mm照相底片在1 mol／L氫氧化鈉溶液中煮沸4小時，然后用水沖洗干凈，做成小箍即可用)。展層容器用小干燥器或小鐘罩，內(nèi)放一小培養(yǎng)皿，倒入5-10 mL展層溶劑進(jìn)行展層，以溶劑前沿走到距邊約0.5cm為度(約10～20分鐘)，取出薄片，然后用吹風(fēng)機(jī)吹干。 4、透射 

將聚酰胺薄膜**于紫外分析儀中，觀察熒光斑點(diǎn)。  

實(shí)驗(yàn)結(jié)果 

                

實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖譜（鉛筆勾線）（從左到右依次為丙氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、混合樣品）  

注意事項(xiàng) 

1、水浴時檢查水浴鍋是否漏水，若漏水應(yīng)及時處理。2、向離心管中加入氨基酸時要做好標(biāo)記，以免弄混。 

3、實(shí)驗(yàn)中要保護(hù)好聚酰胺薄膜，拿的時候要拿光滑面，粗糙一面不得沾水污染，也不得有劃痕，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 

4、點(diǎn)樣時注意毛細(xì)管的內(nèi)徑，若是1mm則點(diǎn)樣一次，若是0.7或0.8mm則點(diǎn)樣2到3次。 

5、每次點(diǎn)完樣要用電吹風(fēng)的冷風(fēng)吹干。 6、點(diǎn)樣的直徑**好不要超過2mm。 

7、展層時注意展層液液面不能高過點(diǎn)樣處，否則樣品會溶于展層液。薄膜在展層液中應(yīng)保持直立，不可卷曲成漏斗狀，否則會使樣品路徑不平行，影響準(zhǔn)確性。 8、圈畫斑點(diǎn)時要戴手套，隔著玻璃觀察，防止紫外線傷害。  

分析討論 

1、水浴時要確保離心管與架子卡死，否則會使離心管漂在水面上，影響水浴效果。離心管的蓋子也要蓋好。 

2、點(diǎn)樣時毛細(xì)管碰一下薄膜即可，若接觸時間過長會使點(diǎn)樣的直徑過大。點(diǎn)樣間的間距控制在1到1.5cm，太近可能會有樣品重疊。點(diǎn)樣應(yīng)處于一條線上，該線距離膜端0.5cm左右。點(diǎn)樣前可用鉛筆畫一條直線，畫線時力度不可過重，否則影響實(shí)驗(yàn)。點(diǎn)樣的力度也要控制好，不可用力過猛。 

3、展層時薄膜用橡皮筋束縛成半圓狀立于裝有展層液的平皿中。建議使用兩個橡皮筋捆綁，否則容易使薄膜卷曲變形。用棉線綁薄膜更好，因?yàn)橄鹌そ羁赡軙в心承┯袡C(jī)物，產(chǎn)生多余的斑點(diǎn)。 #p#分頁標(biāo)題#e#

4、當(dāng)DNS-Cl過多時會產(chǎn)生DNS-NH2，后者在紫外照射下顯示藍(lán)色熒光。所以薄膜中間會有四個藍(lán)色熒光。而賴氨酸與DNS-Cl反應(yīng)生成DNS-ε-賴氨酸的同時也生成了DNS-雙-賴氨酸，所以賴氨酸的條帶有兩個黃綠色熒光斑點(diǎn)，一個為點(diǎn)狀，另一個呈月牙形。 

5、樣品中有兩個斑點(diǎn)，分別與丙氨酸、苯丙氨酸等高，說明樣品中含有丙氨酸和苯丙氨酸兩種氨基酸，而不含有賴氨酸。 

6、在圈畫斑點(diǎn)時要戴手套，用鉛筆輕輕畫線，否則很容易刺破薄膜。